克隆技術在豬方面的研究

借助體細胞移植技術，己成功地獲得了克隆羊、克隆牛和克隆山羊;而在有關克隆豬的專題報告中亦采用該方法，即將未分化的早期胚胎細胞(4細胞的卵母細胞胚)作為供核細胞 與去核卵母細胞融合。經表型選擇后進行的豬克隆繁殖，在內品生產中具有潛在的重要意義。另外，基因修飾技術與克隆技術的結合能為人類創建外源性移植器官的潛在供體。 

　　從分化細胞邁向豬克隆的第一個步驟，就是要對各種可能影響豬體外胚胎發育的因素進行調查研究。從長白種母豬體采集的成熟卵母細胞，經2種電激活方法的任何一種刺激后，促使胚胎以單性生殖方式發育;然后將此胚胎置于微纖絲抑制劑(細胞分裂抑制素B)中，以避免因細胞的分裂而造成染色體的丟失，最后將這些胚胎放大3種不同培養基的任何一種內進行孵化(其它環境條件保持不變)。在一定強度的電激下，經多次脈沖刺激的胚胎其發育數少于采用單次脈沖電激的胚胎;另外，培養基的種類也影響了胚胎的發育，胚胎在 NCSU23培養基中發育情況最佳。隨后，用單一的1.5kv/cmlOOμs脈沖電流刺激NCSU23培養基中的胚胎，在這些條件下測定體外成熟卵母細胞的發育潛力(以體內成熟卵母細胞作對照)。在采用這種電激方式的167個體外成熟的卵母細胞中，有116個在48h內分裂，但是僅4 個發育至胚泡，該比例顯著地低于相應的體內成熟卵母細胞的發育率(p=0.001，X2=檢驗)。因此，在以后的試驗中采用在體內發育的成熟卵母細胞。 

　　在眾多有關家畜克隆的報道中均以胎兒成纖維細胞作為供核細胞，究其原因是這些細胞能在克隆前進行基因修飾。 因此，我們對豬胎兒成纖維細胞在核移植后繼續發育的能力進行了評估。將“梅山×梅山( 黑毛)”豬在妊娠24d時屠殺取其胎兒，經胰蛋白酶作用后建立原代細胞培養。再將細胞進行高密度平板培養傳代2至6次，最后進行融合；在不補充培養基的情況下連續培養l6d，產生的細胞處在G０期，最后用PCR方法鑒定每個胚胎的性別。由于與它們的成纖維細胞抗原性一致，經培養的細胞對細胞角蛋白和階段特異性Ⅰ型胚胎抗原呈陰性反應，但是對中胚層的標記波形蛋白呈強陽性。 

　　由成年體細胞克隆的小鼠系采用特殊的非融合方法，即通過電壓驅動微注射方法選擇性地將供體核導入去核卵母細胞，我們將該方法應用于豬的細胞核移植中。在含有細胞松弛素的NCSU23培養基中，采用電壓驅動微注射方法將取自長白小母豬或黑白花小母豬(長白×杜洛克)卵母細胞中的中期Ⅱ型染色體和第一極體除去，通過電壓驅動微注射將“梅山×梅山(黑毛)”雜交豬的胎兒成纖維細胞核單個導入每個去核卵母細胞。重新生成的胚前體在38℃孵化3～4h，然后用脈沖電激活，最后再對所獲得的核移植胚胎進行培養。 

　　雖然豬胚胎能在體外很好地發育至胚泡階段，但移植到代孕母豬的子宮角后，生長發育情況卻很差。由于要確保母豬能正常妊娠一般至少需要4個胎兒，據此推斷如果子宮內存在經受精產生的輔助胚胎，會有助于克隆胚胎的完全發育。 

　　為了研究輔助胚胎在子宮內促進克隆胚胎發育的能力，設計了2個試驗，克隆胚胎在試驗Ⅰ中經體外培養20h(單細胞 胚胎)或在試驗Ⅱ中經體外培養40h(2-4細胞的胚胎)后，移植到代孕母豬子宮中，所有分娩的后裔仔豬(試驗Ⅰ的9只仔豬和系列試驗Ⅱ的24只仔豬)全為白色，因此，可以證明這些仔豬為非克隆豬。克隆胚胎無法完成4胎的妊娠全過程的事實表明，核移植胚胎和輔助胚胎間的比例是相當重要的，本次試驗中2種胚胎比例顯然不是處在最佳程度。 

　　試驗Ⅲ將在2-8細胞階段間進行核移植的11O個克隆胚胎經成纖維細胞培養基傳代2至6代后，移植到4只 不含輔助授精胚胎的代孕母豬子宮中,其中3只代孕母豬分別在胚胎移植后的27d、35d和6ld 開始發情，豬的發情周期為2ld，發情延遲表明每只代孕母豬已經妊娠。由于豬胚胎在子宮壁著床發生于胚胎發育的13d至l4d，所以很可能其中2只妊娠母豬在胎盤形成后就終止胚胎發育，胚胎終止發育的原因不明。 

　　在第3個試驗中，第4只代孕母豬在接受36個克隆胚 胎的輸卵管移植后仍繼續妊娠，而這些克隆胚胎是在成纖維細胞培養基中傳代至第2代時被取出移植的。其中一個克隆胚胎發育到足月，于2000年7月2日自然分娩，所產仔豬取名Xena，初生體重1.2kg，胎盤重0.3kg，兩者均處于非克隆仔豬的正常值范圍內。仔豬胎盤經解剖觀察表明正常，而有些克隆牛的胎盤畸形，采用核微注射技術的克隆小鼠，其胎盤始終比非克隆小鼠的大得多。　　 

　　Xena克隆豬體質健康、雌性、黑毛色，與“梅山×梅山 ”核供體母體的預測結果相符。為了確證這一結果，從與Xena克隆豬有關的3個相關體 (Xena、長白代孕母豬、培基的成纖維細胞中提取DNA，設23個標識組，進行特異性微衛星標記分析。這些分析是在另外的實驗室里進行的，因而不帶有任何主觀色彩。分析結果證實Xena克隆豬的基因組與梅山豬供核威纖維細胞的基因組屬同一種類，與長白代字母豬的基因組有明顯的區別。　 

　　上述研究結果表明，采用微注射技術將體細胞核移植到去核卵母細胞能成功克隆出豬。雖然還沒搞清全部機理，但推測部分原因是由于微型吸管 的電壓激活時操作快速所致;此外，豬克隆的成敗可能與供核細胞的胞質染色體污染敏感度有關，相對融合(細胞移植，而言，微注射方法更有利核移植的進行。與融合不同，微注射可選擇性地去除大部分供核細胞的細胞質，因而相對而言胞質的含量在胚胎早期是稀薄的。 

　　為了誘發牛和羊的種系突變，曾采用了體外細胞的基因隨機整合技術和基因靶技術，以后則采用與隆有關的技術；這些研究結果為人們展現了這樣一種前景：即這些技術也可以應用于豬。由于豬胚胎干細胞不能進行培養，因此這種技術具有廣闊的應用前景。也可以借助理想基因型的個體復帛技術在常規育種或轉基因中加快豬染色體操作技術的應用。本研究結果連同最近報道的豬胞質內精液注射技術都表明微注技術可推動豬克隆技術的發展。

中國牧業新聞網